本发明公开了属于肿瘤生物治疗技术领域的一种具有抗瘤活性的IL-24多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。本发明利用分子模建的方法设计多肽并人工合成,通过体外增殖实验表明此多肽能有效抑制黑色素瘤和食管癌增殖,为开发出有效的治疗肿瘤的新药奠定了基础。
1.一种具有抗瘤活性的IL-24多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如序列表中SEQxa0IDxa0NO:1所示。
2.根据权利要求1所述一种具有抗瘤活性的IL-24多肽,其特征在于,所述IL-24多肽为人工合成。
3.权利要求1所述具有抗瘤活性的IL-24多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
4.根据权利要求1所述具有抗瘤活性的IL-24多肽在制备抗肿瘤药物中的用途,其特征在于,所述肿瘤为黑色素瘤、食管癌或肺癌。技术领域
本发明属于肿瘤生物治疗技术领域,具体涉及一种具有抗瘤活性的IL-24多肽及其应用。
背景技术
美国哥伦比亚大学Fisherxa0PB教授实验室1995年用重组人IFN-β和密执毒素(mezerein,MEZ)处理人黑素瘤细胞(H0-1)后,通过消减杂交鉴别出mda-7/IL-24。它的分布具有高度局限性,仅分布在免疫系统和特定细胞(如黑色素细胞、痣、早期黑色素瘤细胞、平滑肌细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤伤口边缘和基底类成纤维细胞样细胞),在50多种肿瘤细胞中未检测到MDA-7/IL-24蛋白的表达。近十七年的研究表明,mda-7/IL-24是抗肿瘤的“明星”分子。首先,能够在体内和体外抑制多种癌细胞和肿瘤生长,选择性诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无明显毒副作用,因而认为mda-7/IL-24是一种新的肿瘤抑制基因。其次,mda-7/IL-24与其他的肿瘤抑制基因不同,它对肿瘤细胞的生长抑制作用不依赖于肿瘤细胞中p53、p21、Rb和其他肿瘤抑制基因的表达与否,它能特异性地杀死MCF7和HeLa,而p53对这两种细胞无法发挥杀死作用,它是具有广谱抗瘤活性的肿瘤抑制基因。同时,mda-7/IL-24具有免疫调节能力,它能刺激外周血单核细胞PBMC产生IL-6、TNFβ、IFNγ,但对人PBMC无刺激增殖作用。正在用于基因疗法的临床试验的p53、p10、Rb等抑癌基因,均不具有通过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞的特性,mda-7/IL-24很可能是第一个既抑制肿瘤生长又刺激免疫系统的基因。最后,mda-7和其他药物(表皮生长因子受体EGFR抑制剂gefitinib、Her2的单抗Trastuzumab/Herceptin、Tamoxifen、Taxotere和Adriamycin)的联合使用可产生叠加的抗瘤效果,可提高对二者单独作用都不敏感的肿瘤细胞的药物敏感性,在临床上给这类肿瘤患者带来新的治疗希望。因此,对mda-7/IL-24基因的研究具有非常重要的理论和临床意义。肿瘤手术、放疗和化疗是肿瘤治疗的常用方法,化疗的基本着眼点是借助于化疗药物来杀伤肿瘤细胞,化疗效果好与差的关键问题是提高化疗药物的有效性和特异性,降低其毒副作用。同时,在生物技术药物中蛋白药物是新药开发的重要发展方向之一,蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗;与以往的小分子药物相比,蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠,已成为医药产品中的重要组成部分。腺病毒作为基因转移工具相对于其他病毒载体更有优势,如腺病毒颗粒比较稳定、操作简单、可感染分裂细胞和非分裂细胞、外源基因表达水平较高。然而,腺病毒的靶向性问题、腺病毒的清除、生物安全性等缺陷限制了它的发展。相比较于腺病毒载体,以基因工程蛋白药物的形式直接给药就更为安全。抗肿瘤小分子多肽可针对肿瘤细胞生长、发展的不同阶段,特异性杀伤、抑制肿瘤细胞。它们的分子量小、活性高,对多药耐药的肿瘤细胞系也具有良好的抑制活性;同时,小分子多肽可用多种方式给药,不易引起免疫反应;相对于重组蛋白质类大分子药物,结构易于改造,且人工化学合成的生产成本较低,这些都预示着小分子抗肿瘤肽在临床的应用前景良好。美国学者发现了一条六个氨基酸残基组成的小肽,它在体内能显著抑制肺、胃及在大肠腺癌的生长,为治疗这类死亡率很高的恶性肿瘤开辟了一条新路。瑞士科学家发现另外一个小肽(8个氨基酸残基),它能进入肿瘤细胞,激活抗癌基因p53,诱导肿瘤细胞的凋亡。将多肽与生物可降解的高分子可溶性化合物通过一定化学手段结合成复合物,可赋予多肽类药物一些新的优良性能,如:免疫原性降低或消失、不良反应减少;半衰期延长;专属性强;物理、化学及生物稳定性增强。通常选用的高分子化合物有右旋糖酐、清蛋白、聚乙二醇(PEG)等,其中以PEG最为常用。通过对原来的多肽类药物进行化学修饰不失为一种有效的提高稳定方法,已成为多肽类药物研发的一个途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗瘤活性的IL-24多肽。本发明的目的还在于提供上述具有抗瘤活性的IL-24多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。所述多肽的氨基酸序列如序列表中SEQxa0IDxa0NO:1所示。所述IL-24多肽为人工合成。上述具有抗瘤活性的IL-24多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。所述肿瘤为黑色素瘤、食管癌或肺癌。本发明的有益效果:本发明利用分子模建的方法设计多肽并人工合成,通过体外增殖实验表明此多肽能有效抑制黑色素瘤和食管癌增殖,为开发出有效的治疗肿瘤的新药奠定了基础。
附图说明
图1为检索获得的人IL-24序列信息。图2为hIL-24(TARGET)与IL-19(PDB注册号:1n1f)序列相似性分析。图3为利用同源模建、力学优化技术获得的hIL-24胞外区空间结构。图4为利用K-S规则,基于模拟获得的hIL-24空间结构预测的可能的二级结构模式。图5为基于R-图分析模拟获得的hIL-24空间构型图。图6为IL-24溶剂可及性分析图。图7为IL-24表观静电分布情况图。图8为基于Bindingxa0Site预测模块分析图。图9为IL-24多肽M1的检测,用HPLC方法检测纯度(左图),用质谱MS方法检测分子量(右图)。图10为用免疫荧光细胞染色方法检测肿瘤细胞(A375、Eca-109和A549)和正常的人胚肺细胞(HEL)中IL-24R(IL-20R1、IL-20R2和IL-22R)的表达情况。图11为MTT方法检测IL-24多肽M1对肿瘤细胞(A375、Eca-109和A549)和正常人胚肺细胞HEL体外增殖能力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1xa0xa0xa0xa0IL24多肽的分子模拟设计1、IL-24空间结构的理论模拟通过http://www.ebi.ac.uk检索蛋白质数据库,获得IL-24序列信息如图1所示。从图1可以看出,人IL-24分子由206个氨基酸组成,其中1~51为信号肽,52~206为胞外成熟链。85、99、126为N-糖基化位点。借助http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BlastP对蛋白质结构数据库PDB进行相似性检索,获得与人IL-24序列相似性最高(相似性分数26.8%)的蛋白质为细胞因子超家族成员——人IL-19,PDB注册号为1n1f(Chang,C.,Magracheva,E.,Kozlov,S.,Fong,S.,Tobin,G.,Kotenko,S.,Wlodawer,A.,Zdanov,A.(2003)J.Biol.Chem.278:3308-3313),序列相似性比较结果见图2。利用计算机辅助同源模建技术,借助InsightII2005程序包中的Homology模块搭建hIL-24三维结构。依次选择CVFF、Charmm力场,经最陡下降(收敛判据0.02Kcal/mol,收敛步长200000步)、共轭梯度(收敛判据0.01Kcal/mol,收敛步长250000步)对获得的hIL-24空间构象进行力学优化,获得的稳定构象如图3所示。从图3可以看出,HIL-24具有细胞因子超家族成员的结构信息,由四条长的反平行螺旋结构(图4:螺旋A:13-28;螺旋B:48-69;螺旋C:77-97;螺旋D:110-149)通过无规卷曲连接而成。基于K-S规则确定的二级结构模式如图4所示。利用获得的hIL-24空间结构,通过R-图对其进行结构合理性评估,如图5所示,从图5可看出,获得的hIL-24空间构象是合理的,提示选择的模拟方法、构象优化力场及方法是适当的。2、基于IL-24空间结构的理化性质及表观特征分析蛋白分子的空间结构及其表观性征决定其生物学功能。借助理论模拟获得的hIL-24空间结构,遵循溶剂可及性原理对IL-24分子的溶剂可及性进行分析,图6给出了IL-24溶剂可及性情况,蓝色代表完全暴露在溶液中的氨基酸残基,绿色部分代表埋藏在蛋白分子内部的残基。从图6可以看出,完全暴露在溶剂中的片段为LoopAB(29-50)、LoopCD(100-110),可能构成IL-24潜在的功能位点。利用Delphi程序对获得的IL-24表观静电分布进行分析,如图7所示,图中蓝色代表正电区,红色代表负电区,白色代表中性区。从图7可以看出,LoopAB的N-端、LoopCD的C-端带有较强的负电,LoopAB的C-端、LoopCD的N-端带有较强的正电,可能成为潜在的作用位点。3、IL-24空间结构的潜在活性位点的预测用模拟获得的合理的IL-24空间结构,并结合预测的IL-24表观理化性质(溶剂可及性、表观静电性质),基于结合位点预测方法,合理定义球心,并预测其最可能的活性位置,如图8所示,图中的黄色球为定义的核心位置,绿色点为可能的活性位点。从图7可以看出,IL-24可能的活性位置中,由于E、F位点由螺旋中的残基组成,一般不能成为活性位点。其余A、B、C、D位点均为LoopAB、LoopCD中的残基,LoopAB的N-端、C-端以及LoopCD的N-端成为活性位点的趋势最强。根据前面总结的结果,设计多肽M1如下:22-51氨基酸,VKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAES(EQxa0IDxa0NO:1)。实施例2、IL24多肽的化学合成利用化学合成的方法合成多肽M1,并用高压液相色谱(HPLC)分析多肽的纯度,通过质谱(MS)检测多肽的分子量。多肽M1的HPLC纯度为98.46%,MS分子量为333.34,与理论值3332.68接近,见图9。实施例3、细胞模型中IL-24受体的检测利用免疫荧光细胞染色对所用细胞模型黑色素瘤A375细胞、食管癌Eca-109细胞、肺癌细胞A549和正常人胚肺HEL细胞中表达的IL-24受体(IL-24R)进行检测。具体步骤如下:将细胞以5000细胞/孔的量铺入96孔板;37°C孵箱中培养24小时后,吸去上清,用缓冲液PBS洗细胞两次,每次五分钟,加入4%甲醛溶液,室温固定10分钟;吸去固定液,用PBS清洗五次,加入0.5%的NP40溶液(用PBS缓冲液配制)室温作用10分钟,在细胞膜上打孔;吸去打孔液,PBS洗五次后,加入1%牛血清蛋白溶液(用PBS配制)室温封闭30分钟;吸去封闭液,加入用封闭液1∶10稀释的IL-24R的抗体,加入的一抗分别为:IL-20R1(美国R&D公司,MAB11762),IL-20R2(美国R&D公司,AF1788)和IL-22R(美国R&D公司,MAB2770),用PBS代替一抗的处理作为阴性对照,4°C过夜;吸去一抗,PBS洗五次后,加入用封闭液1∶200稀释的荧光素TRITC标记的二抗(北京中杉金桥公司),室温避光作用1小时;吸去二抗,PBS洗五次后,加入DAPI溶液室温避光染核15分钟;PBS洗两次后,在荧光显微镜下观察和记录结果。从图10可知,A375、Eca-109和HEL表达三种IL-24R(IL-20R1、IL-20R2和IL-22R),而A549仅表达IL-20R2,IL-20R1和IL-22R的表达水平极低。实施例4、IL24多肽在体外对肿瘤细胞杀伤能力检测用MTT法检测细胞经IL24多肽M1处理后的存活率【Cancerxa0Research,2006,66(24):11869-11877】,具体步骤如下:将黑色素瘤A375细胞、食管癌Eca-109细胞、肺癌A549细胞和正常人胚肺细胞HEL以2000细胞/孔的量铺入96孔板,培养24细胞小时后分别加入不同浓度的多肽M1,作用4天后,每孔加入20μl的MTT(5mg/ml),37°C培养4小时后,吸去液体,加入150μl的DMSO溶解沉淀,测定492nm处吸光度。所有的实验重复三次,结果表示为平均值±SE。用SPSS软件对数据进行双侧t分布检验的统计学比较分析,p<0.05为差异显著,p<0.01为差异极其显著。同时,为了进一步确定A375细胞增殖受到抑制是IL24多肽M1的作用,分别将商品化的IL24抗体(免疫原为重组表达全长IL24蛋白,有美国R&D公司单克隆抗体MAB1965和多克隆抗体AF1965两种)和IL24R(IL20R1、IL20R2和IL22R)的抗体与M1一起加到A375细胞培养液中,选取三个M1终浓度1、2、5μg/ml,抗体终浓度均为100ng/ml。其中,细胞存活率=处理样品/未处理样品。结果表明:M1对两种肿瘤细胞A375和Eca的增殖具有显著的抑制作用,并且这种抑制作用可以被IL-24的抗体(多抗AF1965和单抗MAB1965)和IL-24R的抗体(IL-20R1、IL-20R2和IL-22R)所中和。其中,多肽M1在0.5μg/ml时对黑色素瘤A375细胞体外增殖能力有抑制作用,1-200μg/ml时抑制作用极其显著(p<0.01,表示为**,下同),抑制率最高为27%,见图11a;分别加入终浓度为100ng/ml的IL-24和IL-24R的抗体后,多肽的抑制作用被明显中和,见图11b。多肽M1在2μg/ml时对食管癌Eca-109细胞体外增殖能力有抑制作用,10μg/ml时抑制作用明显(p<0.05,表示为*,下同),20-200μg/ml时抑制作用极其显著(p<0.01),抑制率最高为21%,见图11c;同样,这种抑制作用可被IL-24和IL-24R抗体中和,结果见图11d。多肽M1在0.5-100μg/ml对正常的人胚肺细胞HEL体外增殖活力无影响(图11e),同样,多肽M1对只表达IL-20R2的肺癌细胞A549的体外增殖能力影响很小(图11f)。多肽M1对肿瘤细胞A375和Eca-109的增殖有明显的抑制作用,而对正常的人胚肺细胞HEL和IL-24R表达水平较低的肺癌细胞A549影响很小,具有肿瘤选择性。